CRISPR/Cas9指南

1. CRISPR/Cas9指南

 成簇规律间隔的短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，即 CRISPR ）II型系统是细菌免疫系统，现已被改造用于基因工程。在CRISPR/Cas9广泛应用之前，像锌指核酸酶（ZFNs）或转录激活因子类效应核酸酶（TALENs）等基因工程技术，都需要使用定制的DNA结合蛋白核酸酶，这需要科学家为每个基因靶标设计和生产新的核酸酶对(nuclease-pair)。（相比而言，）CRISPR主要因其简单性和适应性，已迅速成为基因工程中最受欢迎的方法之一。
                                           CRISPR包括两个部分：一个向导RNA( gRNA )和一个非特异性CRISPR结合核酸内切酶(CRISPR-associated endonumclease即 Cas9 )。向导RNA是一个短的合成RNA,由一段结合Cas9必需的scaffold序列和特定的约20nt的空载(spacer)或靶向(targeting)序列（靶位点）组成，其中靶向序列决定了用于修饰的基因靶标。因此我们只需改变gRNA上的靶向序列即可改变Cas9的基因靶标。CRISPR最初用于敲除各种细胞类型或生物体的靶向基因，但对Cas9酶的改造已经将CRISPR的应用扩展到选择性激活或抑制靶向基因或纯化特定的DNA区域，甚至可以和荧光显微结合用于展现活细胞中的DNA。而且，产生gRNAs的便捷促使CRISPR成为了最具扩展性的基因编辑技术之一，近来已被应用于基因组水平的筛查。
   这篇指南将提供CRISPR/Cas9生物学方面的概览，介绍CRISPR的不同应用，帮助诸位在各自领域上开展CRISPR/Cas9的研究。
   通过靶向基因特异的gRNA和核酸内切酶Cas9的共表达，CRSIPR/Cas9可用于产生敲除细胞或敲除动物。** 基因靶位点可以是任何满足以下两点条件的约20nt的DNA序列：**
   PAM序列是结合靶标必不可少的，具体序列取决于Cas9的种类（酿脓链球菌Cas9 5’NGG3’）。我们将关注酿脓链球菌Cas9，因其目前广泛使用于基因工程。一旦表达，Cas9蛋白和gRNA将形成一个核糖体蛋白复合物，这个复合物是通过gRNA的scaffold区域和Cas9上表面暴露带正电荷的沟糟相互作用形成的。Cas9与gRNA的结合后构象发生了改变，分子由无活性的非DNA结合构象转变为有活性的DNA结合构象。更重要的是gRNA上的靶位点序列仍未和靶标DNA发生相互作用。Cas9-gRNA复合体将任意地结合基因组上的PAM序列，但是只有gRNA靶位点序列与靶标DNA配对时，Cas9才能进行切割（这段靶标DNA）。一旦Cas9-gRNA复合物结合到一段认定的DNA靶标，在gRNA靶向序列3’端的“种子”序列开始使靶标DNA退火。如果种子序列与靶标DNA序列配对，gRNA将持续的沿3’到5’端方向使靶标DNA退火。
                                           只有当gRNA靶位点序列与靶基因有足够的同源性存在时，Cas9才会作用切割靶基因。拉链式的退火机制可能解释了为什么靶标上3’端种子序列上的错配会完全破坏对靶标的切割，而5’端的错配有可能会对靶标进行切割。Cas9核酸酶有两个功能性内切酶区：RuvC和HNH。当Cas9与靶基因位点结合时发生了第二次构象变化，核酸酶功能区对靶标DNA的反向链进行定位切割。Cas9介导的DNA切割最后结果是目标DNA（PAM序列上游约3～4nt）的双链断裂（double strand break，DSB）。
    双链断裂后由以下两种常规的修复途径进行修复： 
   NHEJ修复途径是最活跃的修复机制，能快速的修复双链断裂，但通常会在双链断裂位点产生小的插入缺失。NHEJ介导的双链断裂修复的随机性具有重要的实用意义，因为Cas9和gRNA在细胞群体中的表达，将产生多种不同的突变。大多数情况下，NHEJ引起的靶标DNA上的小InDels，会导致阅读框内的氨基酸插入缺失，或者移码突变引起的目标基因上ORF提前终止。理想情况下，在靶标基因内形成功能缺失性的突变。然而，对特定的突变细胞表型的敲除能力最终取决于残存的基因功能的剂量。
   当gRNAs设计准确时，CRISPR/Cas9具有很高的特异性，但是特异性依然是一个主要的关注点，特别是当CRISPR应用于临床时。CRISPR系统的特异性主要取决于gRNA靶向序列特异性如何，即基因靶标相比于基因组其余部分的情况。理想状态下，gRNA靶向序列与靶标DNA具有高度同源，而与基因组上其它位置没有同源性。（但）现实是，在基因组上，会有另外的位点与指定的gRNA靶向序列部分同源。这些位点被称为“脱靶”，你在设计gRNA时需要考虑到这些位点。
                                           为了优化gRNA的设计，CRISPR的特异性可以通过改造Cas9自身来得到提升。如先前讨论那样，Cas9通过两个核酸酶功能区域，RuvC和HNH，的结合活性来形成双链断裂。每个核酸酶结构域上精确的氨基酸残基是已知的，这些残基序列对内切酶的活性至关重要（在酿脓链球菌Cas9中D10A对HNH和H840A对RuvC），Cas9酶的修正版已生成，它仅包含一个催化活性功能域(称为“Cas9 nickase”)。Cas9切口酶依然基于gRNA的特异性来结合DNA,但切口酶仅能切开DNA的一条链，形成一个切口“nick”,或使单链断开，而不是双链断裂。使用完好的互补链作为模板，DNA上的切口迅速地被HDR途径（同源性修复途径）修复。因此需要使用两个切口酶来切割靶标DNA的两条链以形成双链断裂（这种通常被称为“double nick”或者“dual nickase”CRISPR系统）。这种需求迅猛地增加了靶特异性，因为这和在足够近的范围内双链断裂产生的两个脱靶的nicks的方式截然不同。因此，如果特异性或者减少脱靶的影响是考虑的关键因素，那么就采用双切口酶方法来产生两个nick引起的双链断裂。为了获得高特异性的基因编辑，切口酶系统也可以联合HDR（同源性修复途径）介导的基因编辑一起使用。
   NHEJ介导的双链断裂修复不够完美，通常会导致基因ORF阅读框的中断，HDR能用于产生特异性的核苷酸改变（这也是人们所说的基因“编辑”），这种改变小到单核苷酸改变大到大片段插入（例如，添加一个荧光基团或者tag）。
   为了利用HDR进行基因编辑，一段DNA”修复模板”序列需要和gRNA+Cas9蛋白／Cas9n蛋白一同转入研究者感兴趣的细胞中。修复模板必须包含所需编辑位点以及紧邻靶标的上下游同源序列（称作左右同源臂）。每条同源臂的长度以及结合位点取决于想要进行的改变的大小。修复模板可以是一个单链寡核苷酸/双链寡核苷酸/双链DNA质粒，这因不同的应用而不同。值得一提的是，修复模板在基因组DNA不能带有PAM序列，否则修复模板将成为Cas9切割的合适目标。例如，PAM序列可以进行突变处理，以至于不再出现，但是基因编码区不受影响（也即，沉默突变）
                                           即使在表达Cas9、gRNA和外源性修复模板的细胞中，HDR效率通常也比较低（低于修饰等位基因的10%）。因此，一些实验室人为地尝试加强HDR，有的是在HDR起作用时同步化细胞周期，有的是通过化学的或遗传学的抑制基因来参与NHEJ。HDR的低效性有许多重要的实用意义。首先，因为Cas9的切割效率相对较高，而HDR效率相对较低，一部分Cas9引导的双链断裂被NHEJ修复。也就是说，最后细胞群体中会包含一些野生型等位基因，NHEJ修复的等位基因，和/或一些所需的HDR编辑等位基因。因此，需要通过实验来验证所需的编辑是否存在，如必要的话，对所需编辑的克隆进行分离。

2. CRISPR-Cas9系统简介

 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）——规律成簇的间隔短回文重复和CRISPR-associated protein 9（Cas9），共同组成了一套系统，是细菌用来防御噬菌体DNA注入和质粒转移的天然防御系统。但现在被人类所重新利用，构建了很强的RNA引导的DNA靶向平台——主要用来基因组编辑、转录扰乱、表观遗传调控等。
   图中是细菌天然免疫系统。我们可以看到，CRISPR locus是由几个原件构成。一开始是个反向转录的RNA，是特异的非编码RNA，可以和重复序列部分互补（trancrRNA，橙色矩形），后面是各种cas基因（箭头表示），接着是CRISPR排列（棕色的菱形是重复序列，彩色的是间隔）。而这些间隔序列是细菌从噬菌体DNA中获得的遗传原件：当噬菌体感染细菌，细菌激活相关的cas基因——Cas1，Cas2,和Csn2，将其中新的间隔序列整合到自身的CRISPR arry中。一旦获得以后，新的spacer就会出现在pre-crRNA中，此时tracrRNA与不同的SPACER互补，在RNaseIII的作用下，产生crRNA，进一步在其他未知的核酸酶的作用，剪切crRNA的5'端，使得引导序列长为20nt。如果噬菌体注入DNA，那么这个免疫系统将被激活，来干扰噬菌体DNA。
                                           我们目前主要使用II型CRISPR系统，它和他的区别在于，只是需要一个DNA内切酶Cas9来对与sgRNA20个互补碱基的带有PAM结构的DNA进行剪切。剪切后是DNA产生平末端的DSB（双链断裂），然后在进行非同源的末端连接过程中，容易随机插入或者删除或者替换。或者进行高保真的同源定向修复，修复DNA。
                                                                                   这里的例子是化脓链球菌的SpyCas9，是一个含有1368个氨基酸的多结构和多功能的DNA核酸内切酶。它的切割位点在PAM上游的第三个碱基，通过HNH（sgRAN互补的目标序列）和RuvC核酸酶结构域（非目标序列）。要识别特定序列并进行剪切，sgRNA与Cas9组合成一个复合体，其中sgRNAy与Cas9结合起着关键的作用，能够使得Cas9构象重构，变得具有活性。crRNA前20碱基使得Cas9具有靶序列特异性，tracrRNA来招募Cas9蛋白。在这个系统中，有一个所谓的种子序列，20碱基spacer的3'端10-12个核苷酸。 在种子序列的错配以及本身同源性都会严重影响系统特异性和脱靶效率。 *   
                                           
    PAM序列非常的关键 ，能够起到识别自身和外来的序列。有实验表明，如果PAM进行但突变，那么就能够让噬菌体入侵宿主。在sgRNA互补之前，首先是寻找PAM序列，如果没有合适的PAM，那么通过蛋白三维结构的坍塌，会离开DNA，直到找到合适的PAM。一旦找到PAM，Cas9就使DNA局部解链，RNA进入，与DNA互补，形成RNA-DNA结构。 sg种子区域序列与靶DNA的完美互补是很重要的。 
   首先，guide RNA的结合，使得Cas9从一个未激活的构象变成具有DNA识别能力的构象。RNA种子序列先形成A型构象，为了目标结合和链入侵，PAM识别位点预先形成用来PAM识别。然后，Cas9结合到PAM序列，使得酶能够去识别附近的潜在的DNA靶序列。一旦Cas9在PAM附近找到了潜在的靶序列，会开始解双螺旋并继续检查剩余的靶序列。磷酸锁环稳定解旋的目标DNA，且第一个碱基开始翻转向上，与guide RNA碱基配对。而Cas9继续与非靶链上的翻转碱基作用，促进双螺旋解开。接着，碱基配对伴随着Cas9构象改变，促进种子序列前面的guide RNA从限制中释放出来，也形成配对，这个过程促使Cas9构象持续变化，直到到达有活性的状态。最终，guide RNA与目标DNA完全互补使得HNH具有稳定的，具有活性的构象，来剪切目标链DNA。与此同时，引起更大的构象变化，使得非目标链DNA进入RuvC催化中心被剪切，这种转态下，Cas9中牢牢结合在靶点序列上，直到其他的细胞因子过来替代它。
                                           读了这篇review，进行一定程度的总结，有些地方还是有些不太清楚。

3. CRISPR Cas9知识储备第一弹：简介

  CRISPR Cas9  --   C lustered  R egularly  I nterspaced  S hort  P alindromic  R epeats CRISPR- A ssociated  P roteins  9 
   Crispr-CAS9系统最初在细菌和古生菌中观察到，作为一种适应性微生物免疫系统，提供对外来病毒和质粒的获得性免疫；已测序物种中，40%的细菌和90%的古生菌可观察到CRISPR基因座，且细菌中可能存在一个以上的基因座。
   入侵的外来DNA被Cas核酸酶切割，然后以间隔序列的形式被保守的重复序列捕获并整合到crispr位点，所获得的间隔物作为创建短CRISPR RNA（crRNAs；create short CRISPR RNAs ）的模板，它与反式激活cRNA（tracRNA；trans-activating crRNA ）形成复合物；它们一起起到引导链的作用，将cas9核酸酶导向互补的入侵DNA（3）。一旦结合，cas9蛋白通过其HNH和RuvC-like核酸酶结构域分别切割“crRNA互补”及反义链。
                                           文献中已描述45个不同的cas蛋白家族，每一个家族在合成cRNA、整合新的间隔序列和切割入侵DNA中具有不同的作用。CRISPR-Cas系统通常分为三类，这取决于Cas蛋白质序列和结构：I型、II型和III型。目前常用于基因组编辑的CRISPR-Cas9系统是一个Ⅱ型CRISPR-Cas系统，它是从化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）改编而来的。
   内切酶是化脓性链球菌产生的细菌CAS9核酸酶蛋白。CAS9核酸酶具有两个DNA剪切结构域（Ruvc1和HNH-like核酸酶域），可剪切双链DNA使双链断裂（DSB；double strand breaks）。
   gRNA是一种工程化的单链嵌合体RNA，结合了细菌tracrRNA的支架功能和细菌crRNA的特异性。gRNA 5'端的最后20bp作为一个归位装置，通过RNA-DNA碱基配对，将CAS9/GRNA复合物招募到PAM(protospacer adjacent motif )上游特定的DNA靶位。不同菌株和不同类型的CRISPR-Cas蛋白之间的PAM序列不同，化脓性链球菌Cas9的序列是5’-NGG。目前的CRISPR-CAS9系统可以直接用于任何5’-N20-NGG DNA序列，并产生精确的双链断裂。然后，通过在几乎所有细胞类型和生物体中发现的两种通用修复机制修复DSB：非同源末端连接（NHEJ；the non-homologous end-joining ）或同源定向修复（HDR；the homology-directed repair）。
                                           NHEJ修复路径是一种容易出错的修复机制，用于在没有合适的修复模板的情况下修复双链断裂。NHEJ通路试图将DSB的切割端连接在一起。然而，这一过程往往导致DSB位点的插入或删除（indels）突变，导致移位或引入永久性破坏目标基因开放阅读框的成熟前终止密码子。尽管NHEJ的INDEL结果很大程度上是随机的，但是科学家们可以通过将gRNA定位于相关基因的N末端来确保最大程度的基因破坏；这将确保框架移位突变不会导致部分功能性基因产物。在利用NHEJ修复通路时，设计第一或第二外显子中的gRNA并避免靶基因的内含子区是一个很好的实践。
                                           除NHEJ，细胞还能够利用一种更精确的修复机制，即同源定向修复（HDR）途径。这种修复机制可以用来引入特定的核苷酸修饰基因组DNA。在这种方法中，将与预期编辑位点上游和下游序列高度同源的DNA修复模板连同适当的gRNA和CAS9核酸酶一起引入细胞。在这种合适的模板存在下，不易出错的HDR机制可以通过重组忠实地对CAS9诱导的DSB站点进行所需的更改。在设计修复模板时，请确保目标序列没有紧跟PAM序列，或者PAM序列被排除或变异。这是为了避免使用相同的CRISPR-CAS9系统对修复模板进行降解。
                                           CRISPR-CAS9系统可以通过gRNA的设计针对任何基因组区域的特异性取决于位于目标序列下游的PAM序列。作为细菌和古细菌免疫系统，PAM识别序列激活CAS9的核酸酶域，从而作为区分自我和非自我的手段（如：阻止CRISPR基因座被靶向）。
                                           PAM识别序列因来源于CAS9核酸酶的细菌种类和类型而异。最常用的II型CRISPR系统使用来自化脓性链球菌的CAS9核酸酶。这种特殊的核酸酶在GRNA序列的3'端识别5'-NGG。其他市售CAS9可识别其他PAM序列。
    Table 1 : PAM Sequences from Different Species and Subtypes of Cas Nucleases.
   Cas9 Nickase是Cas9的一种突变形式，其RuvC1 或HNH-like核酸酶域中分别有D10A 或H840A 突变，这种突变形式导致在目标位点产生单链刻痕而不是双链断裂。由于单链断裂（或缺口）通常使用完整的互补DNA链作为修复模板通过HDR 途径快速修复，因此Cas9 Nickase可将脱靶效应最小化。
                                           为了利用Cas9 Nickase进行基因组编辑，需要两个gRNA。这两个gRNA需设计在相反的DNA链上，但其距离很近，以确保一旦两个链被Cas9 Nickase切割，DSB就会被诱导。这对Cas9 Nickase修改减少了脱靶效应，因为需两个gRNA共同产生一个DSB。一旦形成DSB，NHEJ或HDR路径将被激活以完成基因组编辑过程。
                                           如果共同引入含有所需修饰的修复模板DNA与gRNA和Cas9 nickase，则Cas9 Nickase也可用于通过同源重组产生核苷酸修饰。
    Table 2 : Cas9 Nickase and Nuclease Usage in Gene Disruption and Specific Gene Modification
   Cas9双突变体或Null突变体是通过突变野生型Cas9的两个切割结构域而产生的。 这种Cas9蛋白保留了通过gRNA：基因组DNA碱基配对与基因组DNA结合的能力。 与Cas9核酸酶和Cas9 Nickase可以实现永久性基因破坏不同，Cas9 Null突变体不引入任何基因组修饰。 通过将Cas9双突变体与其他效应蛋白融合，CRISPR Cas9系统可以将其作用扩展到基因调控，基因组成像，染色质或DNA修饰以及染色质免疫沉淀。
                                            Table 3 : Comparison of spCas9, saCas9, and Cpf1 nucleases
   large size and G-rich PAM sequence
   Cpf1于2015年底由麻省理工学院的Feng Zhang小组发现。在16种候选Cpf1蛋白中，两种在哺乳动物细胞中最具潜力的高特异性基因组编辑工具：asCpf1和lb2Cpf1。这些核酸酶在人类细胞中具有与常用spCas9相当的靶向切割效率。
   Cpf1允许新的定位可能性，因为它识别富含T的PAM位点。与Cas9的富含G的PAM要求相比，这显着扩大了可能的基因组目标的范围。虽然Cas9可能是靶向富含G的区域的优选核酸酶，但Cpf1可用于靶向富含T的区域。在哺乳动物细胞中，Cpf1可以靶向如支架/基质附着区域和着丝粒DNA的难以延伸的DNA片段。使用Cpf1还可以探索由富含AT的结构域控制的细菌基因组，例如引起疟疾的恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）。同样，在Cas9的表达有毒的情况下，Cpf1可能是Cas9的有用替代品，如在谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）和几种蓝细菌（Cyanobacteria）中所见。
   Cpf1需要较短的guide RNA才能运作。虽然Cas9需要tracrRNA的存在来处理crRNA，但Cpf1可以自己处理pre-crRNA。这对于生物技术特别感兴趣，因为与用于Cas9的~100nt tracrRNA / crRNA杂交体相比，Cpf1可以仅用~42nt crRNA靶向。这将工程化sgRNA的大小减少了一半以上，同时还简化了与合成和化学修饰相关的方法和成本。这种自编辑功能也使Cpf1成为多重基因组编辑的最佳选择，因为更多的sgRNA可能适合一个载体。
   另一个显着差异是Cas9在切割后产生平端，而Cpf1留下可用于定向克隆的粘性5'突出端。产生粘性末端的其他方法，例如限制酶消化，具有比Cpf1更短的识别序列，因此切割性较低。已经利用Cpf1的这种特性在体外进行高度特异性的DNA组装。在体内使用这种方法，科学家们可以对非分裂细胞（如神经元）进行DNA敲入，通过HDR进行基因组编辑尤其具有挑战性。
   Cpf1切割PAM位点下游18-23bp的DNA，导致NHEJ修复双链DNA断裂后对识别序列没有破坏。导致Cpf1能够进行多轮DNA切割，并且增加了进行所需基因组编辑的机会。相比之下，由于Cas9仅在PAM位点上游切割3bp，因此NHEJ途径导致indel突变，其破坏识别序列，从而防止进一步的切割轮次。理论上，重复的DNA切割轮次应该导致Cpf1导致靶基因的沉默增加，并且在敲入实验的情况下，发生同源定向修复的机会更大。   Zhang等人的一项研究。表明Cpf1介导的基因组编辑可用于纠正诱导多能干细胞和小鼠的肌营养不良基因突变。这导致基因表达恢复，小鼠症状得到纠正。 Cpf1也已成功用于蛋白质-sgRNA复合物中，以突变大豆和烟草植物中的基因。
   虽然化脓性链球菌Cas9（S. pyogenes Cas9; spCas9）是最常用的CRISPR核酸酶，但最近的注意力已转向从金黄色葡萄球菌中分离的微型Cas9核酸酶（S. aureus; saCas9）。这种小核酸酶通过使生物体内基于CRISPR的基因编辑更加可行，具有改变生物医学研究产业的巨大潜力。 SaCas9和spCas9能够以相当的效率在体内切割真核DNA。但saCas9具有几个特性，使其对某些应用更有用。
   SaCas9比spCas9小约1kb，使其能够更有效地包装到较小容量的腺相关病毒（AAV）中，为调控元件，crRNAs和tracrRNAs留下额外空间。通过将Cas9和sgRNA包含在一个构建体（称为All-In-One载体）中，可以在一个转染/转导步骤中完成Cas9表达和sgRNA靶向。由于其低免疫原性和选择性感染某些组织类型的能力，AAV是用于体内研究的优选基因递送方法。
   同样，与spCas9相比，saCas9为基因组编辑开辟了新的可能性，因为它具有不同的定位能力。 spCas9识别5'-NGG-3'的PAM序列，而saCas9识别5'-NNGRRT-3'。可用于PAM序列的更多种类意味着可用于基因组编辑的增加的基因座数量。当需要使用同源定向修复精确编辑基因时，这是特别有益的，因为当识别序列非常接近待编辑区域时HDR最有效。
   saCas9较长的PAM的一个缺点是，该序列在基因组中的发生频率低于spCas9的PAM序列，限制了其潜在的效用。 然而，saCas9较长的PAM序列应该有助于防止脱靶的切割，因为它具有更高的特异性。
   麻省理工学院张实验室于2015年进行的一项研究调查了体内saCas9的表现。 他们将携带saCas9的AAV注射到小鼠体内以破坏PCSK9基因，该基因与家族性高胆固醇血症有关。 这导致1周后肝组织中基因修饰> 40％，注射后4周没有毒性迹象。 最近的其他工作已经用于开发具有使用分子进化的松弛PAM识别特异性的变体saCas9。 与野生型saCas9相比，这种变体允许更大范围的潜在编辑目标，同时保留其小尺寸传达的优势。
                                           锌指核酸酶（Zinc-finger Nucleases; ZFNs）   转录激活因子样效应核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases; TALENs）
    Table 4 : Comparison of current genome editing technologies
    An Intro to CRISPR Cas9 

4. 什么是CRISPR/Cas9技术

当下正火热的CRISPR-Cas9基因编辑技术转自https://proteinlounge.com/animation_list.php

5. CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9, the all-purpose gene scissors could make creating super-humans possible in the future.

6. CRISPR-Cas9系统

一、 CRISPR Cas9起源 
  
 CRISPRCas9系统最初在细菌和古细菌中被发现，是一种细菌应对外来病毒或质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。
  
 当外源DNA首次侵入细菌时，外源DNA被Cas核酸酶切割，并以间隔序列形式整合到CRISPR基因座中。当外源DNA再次入侵时，细菌会以间隔序列作为模板形成短的CRISPR RNA（crRNA），crRNA与反式激活crRNA（tracrRNA）形成复合RNA：该复合RNA作为引导链指导Cas9核酸酶结合到互补的外源DNA。
  
 一旦结合，Cas9蛋白通过其NHN和RuvC1样核酸酶结构域分别切割外源DNA的两条链，使外源DNA降解。
                                          
 Figure 1 : TheCRISPR Locus and its use as an adaptive immune system. a) Invading DNA arecleaved by the CAS gene products and incorporated into the CRISPR Locus asspacer sequences. Different spacer sequences are separated by conserved repeatsequences. b) Once the same invading DNA is detected in the cell, the spacerDNA is expressed in the form of crRNA. The crRNA then complexes with tracrRNAand guides the Cas endonuclease to the foreign DNA for degradation.
  
 迄今为止，已经发现了45种不同的Cas蛋白家族，每种家族在crRNA的合成、间隔序列的整合以及外源DNA的切割方式上有明显的不同。
  
 根据Cas9蛋白的序列和结构不同，CRISPER-Cas9分为三类：I型，II型和III型。目前常用于基因组编辑的CRISPRCas9系统是改良自酿脓链球菌（Streptococcuspyogenes）的II型CRISPRCas系统。
  
  二、CRISPER-Cas9  系统的组成 
  
 CRISPRCas9靶向基因组编辑系统有两个组成部分： 内切核酸酶-Cas9  和 指导RNA-gRNA 。
  
 内切核酸酶是来自酿脓链球菌的Cas9核酸酶蛋白。 Cas9核酸酶具有切割双链DNA的活性结构域（RuvC1和HNH样核酸酶结构域），使得双链DNA断裂。 
  
 gRNA是由起支架功能的tracrRNA与特异性的crRNA结合形成的嵌合RNA。后来，人们将这两段RNA拼接成一条短RNA，称为sgRNA。 
  
 gRNA 5'末端的20bp是特异性的结合序列-寻靶装置，通过RNA-DNA碱基配对将Cas9 / gRNA复合物募集到特异的DNA靶点。
  
 特异性结合序列相邻的是PAM（Protospacer Adjacent Motif）基序。PAM基序是内切核酸酶Cas9的识别位点，Cas9的PAM基序为5'-NGG。Cas9核酸酶在PAM基序上游第3个碱基处切割双链DNA。
                                          
 Figure 2 : The last 20 base pairs of thegRNA acts as a homing device, recruiting the Cas9 endonuclease to theappropriate target sequence. Once there, the two cleavage domains of the Cas9create a double stranded break 3 or 4 base pairs downstream of the PAMsequence. The DSB is then repaired by either the error-prone non-homologous endjoining repair pathway, or the template-dependent homology directed repair
  
  三、CRISPER-Cas9  系统的作用机制 
  
 CRISPR Cas9系统产生双链DNA缺口后，生物体内一般通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）这两种修复方式对断裂的双链DNA进行修复。
  
  修复方式一：非同源末端连接修复途径（NHEJ） 
  
 NHEJ修复途径是一种错误倾向修复机制，用于在缺少修复模板的情况下修复断裂的双链DNA。该途径主要用于CRISPR Cas9系统介导的基因沉默。主要用于当DNA发生断裂时，NHEJ修复途径被开启，DNA断裂处插入或缺失几个碱基，然后双链DNA的切割末端连接在一起，这个过程极容易导致切割位点发生移码突变，从而沉默该基因。因此，在沉默编码基因时， gRNA应靶向基因的N端来确保最大程度的基因破坏。
  
 
  
                                          
 Figure3 :The non-homologous end joining repair mechanism attempts to ligate the endsof the DSB together without the use of a homologous template. This process iserror prone as the loss or addition of a few nucleotides is inevitable withthis mechanism. As a result NHEJ creates InDel mutations which either disruptthe reading frame of the gene or introduce premature stop codons.
  
  修复方式二：同源性定向修复（  HDR  ） 
  
 对比NHEJ修复途径，同源性定向修复（HDR）途径是更为精确的修复机制。这种修复机制主要用于CRISPR Cas9系统介导的基因敲入。在该修复路径中，需要将一段与预期编辑位点上下游紧邻序列具有高度同源性的DNA修复模板、特异的gRNA和Cas9核酸酶一起引入细胞中。在高度同源性DNA模板存在的情况下， HDR机制可以通过同源重组将一段DNA插入编辑位点。这种修复方式可以将一段DNA序列精准地插入特定的基因组位点。
  
 
  
                                          
 Figure 4 : In thepresence of a suitable repair template containing homology arms directlyupstream and downstream of the double stranded break, the recombination-basedhomology directed repair mechanism is used. In this way precise changes—be itadditions or deletion—can be made anywhere in the genome.

7. 简述CRISPRi 和CRISPRa是怎么样在CRISPR-Cas9的基础上改造的？

亲亲，您好！很高兴为您解答。CRISPRi的改造以及CRISPRa改造：通过催化失活的Cas9（dCas9）在靶向原核启动子区域时会导致基因表达的抑制，这是由于转录机制的空间位阻效应。若将dCas9与阻遏结构域（如KRAB）融合，则能实现高效的转录沉默，这个过程被称为CRISPRi（CRISPR干扰）。同时dCas9融合体也可用来激活基因表达，这被称为CRISPRa（CRISPR激活）。与转录激活因子（如VP64和p65）融合的dCas9可靶向启动子和增强子区域，导致基因表达上调。为了增强“战斗力”，dCas9融合体需要招募多个激活结构域。拓展：CRISPRi和CRISPRa仍是相对年轻的技术。与CRISPR-ko或RNAi等成熟技术相比，它的应用还不是很广泛。主要应用有如下几点：1：长链非编码RNA2：分析耐药性3：阐明细胞通路【摘要】
简述CRISPRi 和CRISPRa是怎么样在CRISPR-Cas9的基础上改造的？【提问】
亲亲，您好！很高兴为您解答。CRISPRi的改造以及CRISPRa改造：通过催化失活的Cas9（dCas9）在靶向原核启动子区域时会导致基因表达的抑制，这是由于转录机制的空间位阻效应。若将dCas9与阻遏结构域（如KRAB）融合，则能实现高效的转录沉默，这个过程被称为CRISPRi（CRISPR干扰）。同时dCas9融合体也可用来激活基因表达，这被称为CRISPRa（CRISPR激活）。与转录激活因子（如VP64和p65）融合的dCas9可靶向启动子和增强子区域，导致基因表达上调。为了增强“战斗力”，dCas9融合体需要招募多个激活结构域。拓展：CRISPRi和CRISPRa仍是相对年轻的技术。与CRISPR-ko或RNAi等成熟技术相比，它的应用还不是很广泛。主要应用有如下几点：1：长链非编码RNA2：分析耐药性3：阐明细胞通路【回答】
该技术也有局限性： CRISPR-ko产生真正的null表型，在筛选那些可被残留的低水平蛋白质表达所掩盖的较弱表型时有用，但不适合研究必需基因或药理学抑制。基因产物的药物抑制很少是绝对的，因此基因表达的部分敲除而非完全敲除将更好地模拟药物的作用。【回答】
有没有对应过程图片【提问】
【回答】
【回答】
亲，可以看清图片嘛【回答】

8. CRISPR Cas9系统目前的研究热点在什么方面

1.什么是CRISPR/Cas9？
CRISPR----Clustered Regularly Interspaced 
Short Palindromic Repeats 
是在细菌和古细菌中广泛存在的成簇的、有规律的、间隔的短回文重复序列。07年，发现细菌可以用CRISPR系统抵抗噬菌体的入侵；08年，发现细菌的
CRISPR系统能够阻止外源质粒的转移。是细菌的一种获得性免疫系统。
Cas----CRISPR-associated 
CRISPR/Cas9----CRIPSR-
Cas系统分为Type I、TypeII 、Type III三种类型。在TypeII 
系统中包含一个标志性的Cas9蛋白（参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA或外源质粒)。CRISPR/Cas系统和Cas9蛋白结合成复合
体，发挥识别和降解入侵的外源DNA功能。
2.CRISPR/Cas9的优缺点
优点：

构建方便简单快捷
高效的介导基因定点敲入和基因组的点突变
精确的切口酶活性提高了基因治疗的安全性
缺点：

严重的脱靶性
3.CRISPR/Cas9的用途
   CRISPR/Cas9被改造成第三代人工核酸内切酶（前两代分别是ZFN和TALEN），用于复杂基因组的编辑，目前该技术应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠及细菌的基因组精确修饰。
4.CRISPR/Cas9目前热点
CRISPR/Cas9有个极大的优势就是可以改造为切口酶，在DNA的特定位置制造单链切口，这样不会引起非同源末端连接，但是可以激活同源细胞的重组。
   这套系统目前的主要用途是在以下几个方面：

基因定点InDel突变
基因定点敲入
两位点同时突变
小片段的缺失
编码基因和非编码基因（lncRNA、microRNA）的靶向基因敲除